James Best wurde als Jules Franklin Guy am 26. Juli 1926 in Powderly, Kentucky, als jüngstes von neun Kindern geboren.
Nachdem seine Mutter im Jahr 1929 verstarb, wurde Best von Armen und Essa Best aus Corydon, Indiana, adoptiert. Nachdem er im zweiten Weltkrieg gekämpft hatte wurde er Schauspieler und arbeitete zunächst als Theaterschauspieler.
Zum Anfang seiner Filmkarriere spielte James Best unter anderem neben James Stewart in "Winchester '73". Obwohl er auch in anderen Genres eingesetzt wurde, trat er vor allem als in Westernfilmen und -serien auf. Bekannt wurde Best als leicht trotteliger Sheriff Rosco P. Coltrane in der Fernsehserie "Ein Duke kommt selten allein". Bis zu seinem Tod spielte er in mehr als 600 Film- und Fernsehproduktionen mit. Seine letzte Rolle war Paddy Kerrigan in dem Fernsehfilm "The Sweeter Side of Life". Die Rolle von Joe McBee in dem in Vorproduktion befindlichen Film "Old Soldiers" wird er nun nicht mehr beenden, aber er war Co-Autor am Drehbuch.
James Best lebte bis zu seinem Tod in Florida, wo er als Schauspieler aber auch als Lehrer und Dozent - in erster Linie Schauspielunterricht - arbeitete. Er war dreimal verheiratet, zuletzt von 1986 bis zu seinem Tod mit Dorothy Best. Er hatte zwei Töchter und einen Sohn.
Burt Reynolds der mehrfach mit James Best vor der Kamera stand, darunter in "Rauchende Colts", "B.L. Stryker", "Nobody Is Perfect" und "Um Kopf und Kragen", sagte im Hollywood Reporter: "Egal ob am Set oder hinter den Kulissen, im Unterricht oder einfach als Freund war sein Name Programm, denn er war wirklich der 'Beste' in allem, was er tat. Mein Herz ist schwer und ich vermisse ihn". Auch John Schneider, der in "Ein Duke kommt selten allein" Bo Duke spielte, hat nur gute Erinnerungen an seinen ehemaligen Co-Star: "Ich habe von Jimmie Best an einem Nachmittag mehr über das Schauspielern gelernt als von jedem anderen in einem Jahr", sagte er.
